FRET peptīdu tehnoloģija

Fluorescences rezonanses enerģijas pārnešana (FRET)

Fluorescences rezonanses enerģijas pārnešana (FRET) ir neradiatīvas enerģijas pārneses process, kurā donora ierosinātā stāvokļa enerģija tiek pārnesta uz akceptora ierosināto stāvokli, mijiedarbojoties starpmolekulāriem elektriskiem pāriem.Šajā procesā nav iesaistīti fotoni, un tāpēc tas nav izstarojošs.Šīs pārbaudes priekšrocības ir ātra, jutīga un vienkārša.

FRET testā izmantotā krāsviela var būt identiska.Bet lielākajā daļā lietojumu faktiski tiek izmantotas dažādas krāsvielas.Īsumā, gaismas rezonanses enerģijas pārnešana ir dipolu pāra pārnešana no donora (krāsviela 1) uz akceptoru (krāsviela 2), kad donoru grupa ir satraukta.Kopumā donoru fluoroforu grupas emisijas spektrs pārklājas ar akceptoru grupas absorbcijas spektru."Kad attālums starp diviem fluoroforiem ir atbilstošs (10–100 A), var novērot fluorofora enerģijas pārnesi no donora uz akceptoru."Enerģijas pārneses metode ir atkarīga no receptora ķīmiskās struktūras:

1. Pārvēršas molekulārajā vibrācijā, tas ir, pazūd enerģijas pārneses gaismas gaisma.(Receptors ir gaismas slāpētājs)

2. Emisija ir intensīvāka nekā pats receptors, kā rezultātā rodas sarkanā nobīde sekundārajā fluorescences spektrā.(Receptori ir gaismas izstarotāji).

Donoru grupa (EDANS) un akceptora gēns (DABCYL) ir vienmērīgi saistīti ar HIV proteāzes dabisko substrātu, un, ja substrāts nav atvienots, DABCYL var dzēst EDANS un pēc tam kļūt nenosakāms pret fluoru.Pēc HIV-1 proteāzes atvienošanas DABCYL vairs nedzēš EDANS, un pēc tam var noteikt EDANS luciferāzes.Proteāzes inhibitoru pieejamību var kontrolēt, mainot EDANS fluorescences intensitāti.

FRET peptīdi ir ērti instrumenti peptidāzes nespecifiskuma pētīšanai.Tā kā tā reakcijas procesu var nepārtraukti uzraudzīt, tas nodrošina ērtu metodi enzīmu aktivitātes noteikšanai.Mirdzums, kas rodas pēc peptīdu saišu hidrolīzes, ko veic donors/akceptors, nodrošina fermentu aktivitātes mērījumu nanomolārās koncentrācijās.Kad FRET peptīds ir neskarts, tas parāda pēkšņu iekšējās zibspuldzes izzušanu, bet, kad pārtrūkst jebkura peptīdu saite, kas atrodas pretī donoram/akceptoram, tas atbrīvo zibspuldzi, ko var noteikt nepārtraukti un pēc tam kvantitatīvi noteikt fermenta aktivitāti.